預測酵素及代謝途徑豐富度

PICRUSt2 強大之處可以藉由菌相資料預測獲得 Enzyme Commission (E.C number)、KEGG Orthology (KO)、MetaCyc pathway 豐富度資料，用比較輕鬆的說法就是 : PICRUSt2 可以預測菌群中的酵素及代謝途徑豐富度。

利用 PICRUSt2 的 E.C number 預測結果繪製的組間酵素豐富度比較。

PICRUSt2 輸出資料的註釋

PICRUSt2 分析後主要利用下列三點的檔案解壓縮後視覺化，
分別是以E.C、KO、Pathway :

1. EC_metagenome_out/pred_metagenome_unstrat_descrip.tsv.gz
2. KO_metagenome_out/pred_metagenome_unstrat_descrip.tsv.gz
3. pathways_out/path_abun_unstrat_descrip.tsv.gz

現在並沒有上述的檔案，需要先進行以下步驟。

由於PICRUSt2原始輸出時僅含有酵素及代謝途徑編號，為方便人類判讀，會使用 PICRUSt2 Add descriptions 功能替編號加上註釋 :

操作下列指令時需先啟動 PICRUSt2 環境並 cd 到 picrust2_out_pipeline 資料夾 。

add_descriptions.py \
  -i EC_metagenome_out/pred_metagenome_unstrat.tsv.gz \
  -m EC \
  -o EC_metagenome_out/pred_metagenome_unstrat_descrip.tsv.gz

add_descriptions.py \
  -i KO_metagenome_out/pred_metagenome_unstrat.tsv.gz \
  -m KO \
  -o KO_metagenome_out/pred_metagenome_unstrat_descrip.tsv.gz

add_descriptions.py \
  -i pathways_out/path_abun_unstrat.tsv.gz \
  -m METACYC \
  -o pathways_out/path_abun_unstrat_descrip.tsv.gz

1. 將此輸出的檔案path_abun_unstrat_descrip.tsv.gz、pred_metagenome_unstrat_descrip.tsv.gz拉到本機端並解壓縮，可以獲得分別含有 KO/EC/Pathway、註釋、樣本名、豐富度的 tsv 三個檔案。

   注意 KO 與 EC 出來的檔名相同，避免混淆可以重新命名

2. 這三個 tsv 各複製一個新檔案，新檔案以Excel開啟 (怕不小心用壞了)。
3. 可選擇刪除 function/pathway column 或是 description column，
   這個動作是決定後續本教學的縱軸顯示(如開頭圖)。
   (當然有能力自己寫程式視覺化就可以不刪，交給程式處理~)
4. 本篇範例使用EC_metagenome_out/pred_metagenome_unstrat_descrip.tsv.gz
   解壓縮後刪除 function column ，完成後檔案如下所示 :

   description	CRC_A	CRC_B	CRC_C	CRC_D	...
   Alcohol dehydrogenase	18794.29	19032.78	31185.93	17137.23 ...
   3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein] reductase	43579.57	32083.94	60889.85	31771.04
   .
   .
   .
   

5. 將sample-metadata.tsv拉到本機端，並刪除#q2:types 那一行，完成後如下 :

   sample_name	Index	Sex
   CRC_A	CRC_A	Female
   CRC_B	CRC_B	Female
   CRC_C	CRC_C	Female
   CRC_D	CRC_D	Male
   CRC_E	CRC_E	Male
   CRC_F	CRC_F	Male
   

STAMP 圖形化介面視覺化軟體

做研究已經很辛苦了，這邊採用使用者友善的菌相功能預測視覺化軟體 STAMP :

There are many possible ways to analyze PICRUSt2 output. STAMP is one tool that can be used that requires no background in scripting languages.
Reference : picrust

1. 先下載
   Windows 版下載、Mac 下載方式

   純指令的 Linux 系統 是開不起來的，需使用圖形化作業系統。

2. Ctrl + O 載入檔案，
   Profile file 是‵pred_metagenome_unstrat_descrip.tsv，
   Group metadata file 是 sample-metadata.tsv
   

3. 將組別設定切換進來，範例我們調整到 Sex 組 (因為Index一人一組在這裡無意義)，若有不同組別可之後再調整 :

   

4. STAMP 提供三種類別，多重組別、兩組比較、兩樣本比較，
   先選 Two samples (左圖)，再選擇產圖方式，這邊我們選 Profile bat plot (右圖):
   

5. 仔細看軟體有很多參數可以調整(選擇樣本、統計檢定方式、p value等)，
   也能在 Configure plot 調整圖片參數。調整完後可以按Ctrl + s存圖，
   檔名用英文，中文會報錯!

STAMP 視覺化結果

以下皆使用軟體預設的統計方式 :

• Profile bar plot

  

  E.C. number abundance / Two samples / CRC_A & CRC_B / Profile bar plot

• Extended error bar

  

  E.C. number abundance / Two groups / Female & Male / Extended error bar

• Heatmap plot

  

  Pathway abundance / Mutiple groups / Heatmap plot /
  Width : 12, Height : 50 in Configure plot (原圖過長已裁切)

本篇使用到的輸入檔案 :
EC_metagenome_out/pred_metagenome_unstrat.tsv.gz、KO_metagenome_out/pred_metagenome_unstrat.tsv.gz、
pathways_out/path_abun_unstrat.tsv.gz

學完基礎 NGS 16S rRNA 生資分析了 !

經歷觀念介紹、檔案製備、品質管制、視覺化資料、多樣性統計、功能性預測等，
如果你趁著一股熱血做到這裡，差不多表情長這樣 :

最難的永遠不是產圖，而是找出數據背後的生物意義。
喘一口氣，
下篇整理過去點點滴滴，最後幾篇迎接更炫炮的第三代定序 (TGS) 資料分析 !!