尋找各組別的 Biomarker 菌種

在先前教學文章中介紹了各式各樣生資工具，
儘管 Alpha 與 Beta 多樣性分析可以一覽組內與組間的特徵，
若想要一窺究竟是哪些菌種在組別間數一數二發光發熱，
LEfSe 就是一款以統計分析為基礎，
在組別間進行比較，
獲得各組別微生物生物標記 (Biomarker)的軟體。

左側由內到外的每一層同心圓分別代表界~種的生物階層，每一點代表一個某階層的名稱，黃色表示無顯著差異，紅綠等顏色則代表該菌種在對應組別具有顯著差異。
右側則為 LDA Score 結果，在本圖中橫軸負數代表偏向紅色組，正數則代表偏向綠色組，量化後絕對值後數值越大代表越顯著。
(Segata, Nicola, et al., 2011)

為方便後續講解我們做個小約定，
在本篇提及的「菌種」二字指的是不同階層的分類名稱，
暫時拋下生物嚴謹定義的種一詞為「種 (species)」層級，
因為我們會提及不同階層，
例如菌物界為一菌種、擬桿菌門為一菌種，
在我找到一個合適的名詞取代之前大家忍耐一下> <

LEfSe 分析原理三部曲

上圖中的a, b, c即對應下列點 1, 2, 3，Class1, Class2即不同組別。
(Segata, Nicola, et al., 2011)

1. 挑選出多組間豐富度有差異的菌種們 (初賽)

   • Kruskal-Wallis 多樣本中位數差異檢定
     在不同組別的之中，想知道多組的樣本間該菌種是否有差異，
     LEfSe 第一步使用了Kruskal-Wallis檢定，
     此檢定為無母數方法，樣本數較小(小於30)，
     且適合欲分析對象含有三組以上樣本，
     最終得出具有顯著差異之候選菌種們，
     在上圖(a)的例子中B, D, E, Y 通過了初賽。

2. 將有差異的菌種們於兩組間相互比較 (複賽)

   • Wilcoxon 雙樣本中位數差異檢定
     得出具有顯著差異之候選菌種們之後，
     進入兩兩組別互相廝殺的賽制中，
     LEfSe 第二步使用了 Wilcoxon 檢定，
     該檢定同樣為無母數方法，樣本數較小(小於30)，
     且適合欲分析對象為兩組樣本相互成對，
     最終得出兩兩比較後仍有顯著差異晉級之候選菌種們，
     在上圖(b)的例子中B, D, Y通過了複賽。

3. 評估候選菌種的影響力 (決賽並排名)

   • LDA (Linear Discriminant Analysis) 線性判別分析
     晉級決賽的候選菌種們，
     最後要進行評估此菌種在組中的影響力，
     並化為分數進行排名 (LDA score)。
     LDA 與 先前提及 Beta Diversity 中 PCA 相似，
     都是透過降維方式了解各樣本間的相似程度，
     但 PCA 使用的是非監督式學習 (unsupervised learning)
     而 LDA 採用的是監督式學習 (supervised learning)，
     想不到這裡也藏了機器學習(?) 可參考Tommy大大文章。
     用個超級輕鬆講法就是 LDA 相對於 PCA ，
     在請電腦做降維前，先告訴它 :
     「嘿嘿我們哪些樣本是屬於哪一組(告知分組狀態)」，
     電腦之後就能比較清楚的劃分組間的界線，
     留下更容易區分各組的維度，
     在上圖(c)的例子中將B, D, Y 量化顯著差異的程度。

所需的輸入檔案

1. 分析前的註釋檔案 sample-metadata.tsv [Day 06]
2. 品質管制後的檔案 table-dada2.qza [Day 08]
3. 物種分配後的檔案 taxonomy.qza [Day 11]

所需的環境

LEfSe 所吃的輸入檔案比 [Day 19] PICRUSt2 所需的檔案格式複雜且傲嬌，
有位偉大的前輩受不了製作輸入檔案的痛苦，
開發了dokdo 套件拯救芸芸眾生。

在啟動 QIIME2 環境的前提下，
安裝 dokdo 套件，幫助製作 LEfSe 所需的輸入檔案。

經測試發現，QIIME2版本需要在2022.2(含)以下才能順利安裝dokdo，
因此本篇文章以QIIME2 2022.2版本教學。

安裝 QIIME2 2022.2

wget https://data.qiime2.org/distro/core/qiime2-2022.2-py38-linux-conda.yml

conda env create -n qiime2-2022.2 --file qiime2-2022.2-py38-linux-conda.yml

啟動 QIIME2 環境

conda activate qiime2-2022.2

安裝 dokdo 套件

conda install -c hcc dokdo

下回會介紹分析的實作 !

我也不知道為什麼會有 Day 31 ，興致一來就有了。