可以去掉條數不多的樣本嗎 ? 取樣深度 (Sampling depth)

還記得[Day 09] 提及的品質控制(Quality control)嗎?

在範例的檔案中，可以發現六個樣本經過篩選條數如下 :
(其實就是上圖中最右邊的條數)

• 可以挑掉剩餘條數不多的樣本嗎?

  例如我們可以發現 CRC_D 19914 條數略少於其他組。
  而假設今天樣本 N=100 分成四組，總有一些定序後條數明顯少於其他樣本，
  因為後續將進行物種多樣性的分析統計等，深怕影響最終結果，
  希望能將一些樣本去除，畢竟條數少可能造成偏差(bias)。

  如果你是生科相關科系學生，在做蛋白質定量法繪製標準曲線(standard curve)時，
  若做了蠻多個點，可能也會刪去幾個讓R^2結果更漂亮 (笑 :
  
  Reference : ZGENEBIO BIOTECH INC.
  而取樣深度 (Sampling depth) 也有異曲同工之妙，
  刪去幾個各種原因造成的低序列數樣本，讓整體結果更有說服力。

• 取樣深度要設多少? 低於多少需要挑掉?

  這題並無標準答案，據 QIIME2 開發團隊表示 :
  分析者必須在 :
  留下最多的序列條數 (The most sequences)及
  留下最多的樣本 (The most samples) 做平衡，
  如果樣本數少、當作練習、樣本很難採集，
  且條數差距不大(可能都有幾萬條)，可以考慮都留下，
  若樣本數多，動輒數百，則 QIIME2 提供取樣深度網頁拖拉服務，
  提供切一刀的數字參考 :

  先將[Day 09]得到的 table-dada2-240.qza轉換為qzv

  qiime feature-table summarize \
    --i-table table-dada2-240.qza \
    --o-visualization table-dada2-240.qzv \
    --m-sample-metadata-file sample-metadata.tsv
  

  完成後會顯示 :

  '
  Saved Visualization to: table-dada2-240.qzv
  '
  

  拖曳到 QIIME2 VIEW，右側有個滑桿~
  可以依據組別進行觀察 (sample-metadata.tsv中含有 Index 一人一組與 Sex)，
  深度取的越深，留下來的樣本就越少(紅色代表該樣本會被篩掉)，
  

  Index 個別樣本觀察。

  

  Sex 組別觀察，可發現深度取越深，各組所剩的樣本數會開始不平均，
  以範例來說，會發現 Male 組樣本數會下降較多，
  所以該取多少是分析人要思考的問題。

• 在範例我們取 Sampling depth = 19914 ，也就是取最低的CRC_D 值，即全數保留。

  主因是樣本數很少(N=6)很可憐了，捨不得放棄他們，
  再者其實條數都算多，之後的稀疏分析(Alpha Rarefaction)會介紹，
  實務上，其實有上萬條都很足夠，
  但若遇到同採集條件的樣本卻只有一兩千條，就要思考要不要去除。

  如果你心中叛逆的性格被挑起了，
  範例檔案可以設 19915，(即只高最低的樣本1，使得N=5)，不影響後續教學。
  備註 : 每次QC結果剩餘的條數因演算法關係，可能略有不同，
  就算同為範例檔案，也可能有個位數條數差異，
  所以在這裡深度以自己跑分析的結果為主。

怎麼辦，我有選擇困難，都有上萬條我不知道誰要留阿QQ，覺得都好重要，
都留下吧! 不然跟教授解釋200個樣本下去分析怎麼剩下150個也是蠻麻煩的
取樣深度取最低的樣本序列條數 = 全部保留
(翻找好多 QIIME2 社群問答歸納的結論XD)

本篇使用到的輸入/輸出檔案 :
Input : table-dada2-240.qza、sample-metadata.tsv
Output: table-dada2-240.qzv

拿起一張便條紙記下 Sampling depth，
以及最大的序列條數 (範例是:50131) 之後會使用到~

下回是多樣性統計!