序列剪切 (Trimming) 是門藝術

實務上由於往往無法從文獻、學長姊(X 中得知，
究竟得到的序列是不是含有 Adapter、Barcode，
於是嘗試不同的剪切片段就是很重要的步驟。

想像在平行時空下，[Day 07] 的我們獲得了三張便條紙，
上頭寫著每條序列只留下 :

1. 0~250 nt 片段 (總長 250 nt，都不切)

   qiime dada2 denoise-paired \
     --i-demultiplexed-seqs demux.qza \
     --p-trim-left-f 0 \
     --p-trim-left-r 0 \
     --p-trunc-len-f 250 \
     --p-trunc-len-r 250 \
     --o-table table-dada2-250.qza \
     --o-representative-sequences rep-seqs-dada2-250.qza \
     --o-denoising-stats stats-dada2-250.qza \
     --p-n-threads 8
   

2. 10~250 nt 片段 (總長 240 nt)

   qiime dada2 denoise-paired \
     --i-demultiplexed-seqs demux.qza \
     --p-trim-left-f 10 \
     --p-trim-left-r 10 \
     --p-trunc-len-f 240 \
     --p-trunc-len-r 240 \
     --o-table table-dada2-240.qza \
     --o-representative-sequences rep-seqs-dada2-240.qza \
     --o-denoising-stats stats-dada2-240.qza \
     --p-n-threads 8
   

3. 30~240 nt 片段 (總長 210 nt)

   qiime dada2 denoise-paired \
     --i-demultiplexed-seqs demux.qza \
     --p-trim-left-f 30 \
     --p-trim-left-r 30 \
     --p-trunc-len-f 210 \
     --p-trunc-len-r 210 \
     --o-table table-dada2-210.qza \
     --o-representative-sequences rep-seqs-dada2-210.qza \
     --o-denoising-stats stats-dada2-210.qza \
     --p-n-threads 8
   

• stats-dada2 資料視覺化

  一樣做視覺化輸換 (.qzv)，這次只做 stats-dada2.qza。
  (這邊指令以總長240 nt 為例)
  輸入 :

  qiime metadata tabulate \
    --m-input-file stats-dada-240.qza \
    --o-visualization stats-dada2-240.qzv
  

  完成後會顯示 :

  "Saved Visualization to: stats-dada2-240.qzv"
  

• stats-dada2 資料解讀

  1. 不合格，Non-Chimeric 通過條數過低 : 0~250 nt 片段 (總長 250 nt，都不切)
     

     可以發現到如果都沒有切 (或起始切太少)，
     從 merged 到 non-Chimeric 出現驟降(多數剩下不到1%)，
     代表原始序列起始端可能含有 Adapter 或 Barcode，
     讓 DADA2 誤以為這是 PCR 造成的嵌合體(chimera)
     (聚合酶表示無辜) :
     

     殘餘的 Adapter 未切除乾淨(左)，被 DADA2 誤認是大大大大大 Primer的錯誤黏合(右)
     圖源參考Illumina, ISB Microbiome Course 2020, flaticon重組繪製。

  2. 合格 : 10~250 nt 片段 (總長 240 nt)
     
     這個很乖，是合格的，實務上通常 Filter 會是掉最多的，後續篩選都不會有過大的降幅。

  3. 不合格，Merged 通過條數過低 : 30~240 nt 片段 (總長 210 nt)
     

     這是剪切過多造成的結果，
     從 denoised 到 merged 出現驟降(剩下不到10~30%，甚至 < 1%)，
     代表原始序列起始端與末端剪接過多，
     雙尾定序 (Paired-end) 的特性就是最後會組裝在一起 [Day 05]，
     若是剪切時切除了兩序列重疊的片段，
     就會整個樣本的序列都找不到另一半(單身樂園?，
     最後大家都會被 DADA2 狠心淘汰 (Q

生物資訊的資料分析做實驗相同，都是需要不斷試錯，
最後，快快樂樂的拎著10~250 nt 片段 (總長 240 nt) (即[Day 08]產出的三個.qza檔案)，
繼續 QIIME2 分析的旅程~

本篇使用到的輸入/輸出檔案 :
Input : demux.qza
Output: stats-dada2-250.qza、stats-dada2-240.qza、stats-dada2-210.qza、stats-dada2-250.qzv、stats-dada2-240.qzv、stats-dada2-210.qzv

下回是物種分類 (Taxonomy assignment)!