情境 : 森林裡的樹木多樣嗎?

假設你走路走著撞見了一片森林，
想知道森林中樹種多樣化程度，要如何進行量化分析呢?

在生態學角度，
「多樣」這件事情可以分成
物種豐富度 (Species richness)、物種均勻度 (Species evenness) :

• 物種豐富度 指的是物種的數量，數量越多豐富度越大。
• 物種均勻度 指的是群集(community)中物種數量的分配情況，
  物種彼此數量越接近，均勻度越高。
  Reference : 科學 Online

森林1 與 森林2 進行比較，
兩者物種豐富度 相同，都是16顆樹，
但 森林1 4個不同物種數量接近(均勻)，物種均勻度 森林1 > 森林2 :

Reference : bioninja

回到分析，每個組裡面的物種(菌相)多樣嗎?

我們把森林1、森林2... 想像成範例檔案中 Female、Male 兩組，
想知道女性與男性組內的菌相多樣性如何? 並量化成數字做成圖

我們可以用 組內多樣性 Alpha diversity 找到答案，
「組內」指的是樣本內的意思，觀察樣本內的多樣性情況，
QIIME2 提供三種指數進行計算 (嗅到生物統計學的味道了 :

• 物種豐富度指數 (Species richness)
• 物種均勻度指數 (Species evenness)
• 物種多樣性指數 (Diversity index)

並提供兩種視覺化呈現方式 :

• 稀疏曲線 (Rarefaction curve)
• 箱形圖 (Box plot)

先把程式跑完，後面慢慢解讀~

• 繪製多樣性分析 (Alpha and Beta diversity)

  先啟動 qiime2-2022.8 環境
  conda activate qiime2-2022.8

  會使用到rooted-tree.qza、table-dada2-240.qza、sample-metadata.tsv
  帶上[Day 15] 的便條紙，這邊要告訴 QIIME2 最大的序列條數是多少 :

  qiime diversity alpha-rarefaction \
    --i-table table-dada2-240.qza \
    --i-phylogeny rooted-tree.qza \
    --p-max-depth 50131 \
    --m-metadata-file sample-metadata.tsv \
    --o-visualization alpha-rarefaction.qzv
  

  --p-max-depth : 可視為所有樣本中，最大的序列條數

  完成後會顯示 :

  '
  Saved Visualization to: alpha-rarefaction.qzv
  '
  

  同一張便條紙，這邊要告訴 QIIME2 統計的取樣深度是多少 :

  qiime diversity core-metrics-phylogenetic \
    --i-phylogeny rooted-tree.qza \
    --i-table table-dada2-240.qza \
    --p-sampling-depth 19914 \
    --m-metadata-file sample-metadata.tsv \
    --output-dir core-metrics-results    
  

  --p-sampling-depth : 取樣深度
  --output-dir : 輸出的資料夾，若原本無此資料夾會自動創一個，
  因為此次產出檔案眾多，用一個資料夾裝他們。

  完成後會顯示 :

  '
  Saved FeatureTable[Frequency] to: core-metrics-results/rarefied_table.qza
  Saved SampleData[AlphaDiversity] to: core-metrics-results/faith_pd_vector.qza
  Saved SampleData[AlphaDiversity] to: core-metrics-results/observed_features_vector.qza
  Saved SampleData[AlphaDiversity] to: core-metrics-results/shannon_vector.qza
  Saved SampleData[AlphaDiversity] to: core-metrics-results/evenness_vector.qza
  Saved DistanceMatrix to: core-metrics-results/unweighted_unifrac_distance_matrix.qza
  Saved DistanceMatrix to: core-metrics-results/weighted_unifrac_distance_matrix.qza
  Saved DistanceMatrix to: core-metrics-results/jaccard_distance_matrix.qza
  Saved DistanceMatrix to: core-metrics-results/bray_curtis_distance_matrix.qza
  Saved PCoAResults to: core-metrics-results/unweighted_unifrac_pcoa_results.qza
  Saved PCoAResults to: core-metrics-results/weighted_unifrac_pcoa_results.qza
  Saved PCoAResults to: core-metrics-results/jaccard_pcoa_results.qza
  Saved PCoAResults to: core-metrics-results/bray_curtis_pcoa_results.qza
  Saved Visualization to: core-metrics-results/unweighted_unifrac_emperor.qzv
  Saved Visualization to: core-metrics-results/weighted_unifrac_emperor.qzv
  Saved Visualization to: core-metrics-results/jaccard_emperor.qzv
  Saved Visualization to: core-metrics-results/bray_curtis_emperor.qzv
  '
  

  沒錯，就是這麼多，跑出了滿滿的統計圖，真的是很方便。

本篇使用到的輸入/輸出檔案 :
Input : table-dada2-240.qza、rooted-tree.qza、sample-metadata.tsv
Output: alpha-rarefaction.qzv、core-metrics-results (folder)

下回是多樣性統計解讀時間!