三代定序分析主程式 pb-16S-nf v0.3

QIIME2 對於二代定序資料高度支援，
但在第三代定序的資料相容性上仍未完善，
本篇採用由 PacBio 官方於 2022.8 出品，
結合 QIIME2 等眾多套件的超級方便軟體 pb-16S-nf，
並擁有下列特色 :

1. 單一指令執行所有分析流程
2. 自帶兩種分類器 VSEARCH 與 Naive Bayes classifier
3. Naive Bayes classifier 結合 SILVA, GTDB and RefSeq + RDP 多重資料庫
4. 內建 Krona 動態圓餅與 PICRUSt2 基因功能預測

仔細看標題軟體版本為 v0.3 難不成是測試版 ?
對，就是拿麼新，你已經站生物資訊的浪頭上了( •̀ ω •́ )✧

這裡附上一張 PacBio HiFi 平台與其他產品/競品比較，
使用自己的序列檔案時要留意是否符合下圖綠色框框的標示 :

(Logsdon, G. A., Vollger, M. R., & Eichler, E. E., 2020)

• 分析流程 (Worlflow)

  根據官方釋出資料，會發現其流程與[Day 05]介紹的 QIIME2 大致一致，
  圖中包含 :
  Input -> Trimming -> QC -> Taxonomy classification -> Phylogenic tree, diversity analysis, visualization ...
  

  觀察紅色字體部分，可以發現與先前介紹的步驟相當類似。若沒有分析過次世代定序資料，強烈建議先實作完 NGS 分析再學習三代會比較上手 !
  Reference : pb-16S-nf

  比起 QIIME2 本身， pb-16S-nf 又囊括了更多套件補足 QIIME2 在三代分析的不足，
  甚至提供一鍵跑完上述所有流程 !

• 安裝環境

  • conda 建置環境與安裝 Mamba 及 Nextflow 輔助套件

    conda create --name TGS python=3.8
    
    conda activate TGS
    
    #建立一個名為 TGS 虛擬環境，並進入環境
    

    conda install mamba -n base -c conda-forge
    
    mamba init
    
    #多執行緒版 conda install，若是一路學習過來的讀者，mammba 已在 [Day 19] 安裝，可跳過這兩行
    

    conda install -c bioconda nextflow
    
    #提供自動執行 Pipeline、中斷能繼續分析的軟體，pb-16S-nf 需要它
    

  • 下載 pb-16S-nf 主程式

    git clone https://github.com/PacificBiosciences/pb-16S-nf.git
    #這個連結會下載最新版本的pb-16S-nf
    
    #############################
    #2023.01.29 補充說明 :
    #若在後續步驟中發現不明原因的報錯，
    #可以嘗試重新安裝本篇採用的v0.3版本 :
    
    wget https://github.com/PacificBiosciences/pb-16S-nf/archive/refs/tags/v0.3.tar.gz
    #下載v0.3版本
    
    tar zxvf v0.3.tar.gz
    #解壓縮
    
    mv pb-16S-nf-0.3 pb-16S-nf
    #更改檔名之後(以便與後續教學吻合)可前往下一步驟
    
    

  • 修正配置檔案 (v0.3版才需要做這步驟，新版可跳下一點:初始化與下載資料庫和分類器)

    這裡有個神奇 Bug ，會導致安裝失敗，
    需要修正配置檔案 qiime2-2022.2-py38-linux-conda.yml
    我們需要先將 bioconductor-genomeinfodbdata 版本要求調整 :

    cd pb-16S-nf/env
    #進去 pb-16S-nf/env資料夾
    
    vi qiime2-2022.2-py38-linux-conda.yml
    #編輯 qiime2-2022.2-py38-linux-conda.yml
    

    找到 bioconductor-genomeinfodbdata=1.2.7，
    將其改為 :

    bioconductor-genomeinfodbdata=1.2.6
    

    不知道什麼原因 1.2.7 載點失效，於是降版。

    :wq 儲存後，回到 pb-16S-nf 資料夾 :

    cd ..
    

  • 初始化與下載資料庫和分類器
    過程會有點久，可以先去看場電影，可以開 screen 跑 :

    nextflow run main.nf --download_db
    #開始下載物種資料庫與分類器
    

    完成畫面 :

    executor >  Local (1)
    [8b/ae67a7] process > pb16S:download_db [100%] 1 of 1 ✔
    'Completed at: 04-Oct-2022 00:00:08
    Duration    : 12m 22s
    CPU hours   : 0.8
    Succeeded   : 1'
    

• 測試是否安裝成功

  echo -e "sample-id\tabsolute-filepath\ntest_data\t$(readlink -f test_data/test_1000_reads.fastq.gz)" > test_data/test_sample.tsv
  
  #Create sample TSV for testing
  
  nextflow run main.nf \
    --input test_data/test_sample.tsv \
    --metadata test_data/test_metadata.tsv \
    -profile conda \
    --outdir results
  
  #運行小小的測試資料，這指令內容是不是有點熟悉~
  

  順利的話會出現如下圖所示的提示訊息，就可以快樂前往下一天 :
  

  如果有未安裝完全的環境，在過程中會自動補齊，
  補齊過程有點久，可以去運動再回來。
  Reference : pb-16S-nf

• 報錯情況

  • csvtk: command not found 報錯

    如果遇到紅字報錯且含有以下文字:

    Command error:
    .command.sh: line 2: csvtk: command not found
    

    執行以下指令補安裝csvtk套件，並刪除先前的測試資料紀錄 :

    conda install -c bioconda csvtk
    
    rm -r report_results
    

    再重新執行測試資料分析 :

    nextflow run main.nf \
      --input test_data/test_sample.tsv \
      --metadata test_data/test_metadata.tsv \
      -profile conda \
      --outdir results
    

下回是範例序列下載與製作輸入檔案~