短片段且解析度有限的 NGS 次世代定序

在 [Day 05] 的 16S rRNA 介紹中，
曾經提及 NGS 的技術限制在單條超過 300 bp 品質就會急速下降，
使得 16S 定序中，以 V3-V4 區域(~470 bp)雙尾定序為主，

細心的你如果有注意到，會發現在 [Day 11] 出現的分類柱狀圖，
其物種階層多半停留在 Genus 階層，鮮少見到 Species 階層，
主因就是 V3-V4 對於物種的解析度(resolution)的限制 :

[Day 11] 的分類柱狀圖，分類結果多半停留在 Genus 階層。

若能夠一股作氣定序 V1-V9 (~1500 bp)就皆大歡喜了，
難道沒有更好的方法了嗎 ? 有的，就是第三代定序 !

長片段 (long-read) 三代定序的主流爭霸

有別於短片段 (0.25 kb) 在 [Day 03] 提及由 Illumina 幾乎獨佔，
截至目前長片段 (5~1000 kb) 定序
則有 PacBio / Oxford Nanopore 兩大公司激烈競爭中，
如同前端框架 React.js 與 Vue.js 之爭一樣火熱，
礙於研究生時間寶貴 (剛好用過 PacBio )，
之後會以 PacBio 當作範例。
(Logsdon, G. A., Vollger, M. R., & Eichler, E. E., 2020)

第三代定序 Third Generation Sequencing (TGS) - 以 PacBio SMRT 為例

Pacific Biosciences (PacBio) 提出
將一段髮夾狀 adapters 連接於目標序列兩端，
使其成為環狀結構，稱為 SMRTbell ，再配上引子與聚合酶 :

並將每個 SMRTbell 置於 SMRT cell 上獨立的小洞洞(ZMWs)，
讓聚合酶乖乖地合成，
合成過程中同時讀取帶有螢光標定的 dNTP 發出的訊號進行定序 :

因為 SMRTbell 呈現一個 Loop 形狀，這讓聚合酶可以瘋狂轉圈圈合成，
以此增加定序的準確度，最終產生高品質的序列 (HiFi read) :

稱為 Circular Consensus Sequencing (CCS)，
另外也有 Continuous Long Read (CLR) 適用於 >50kb 的定序方式。
Reference : PacBio

也推薦讀者可以去看看 Oxford Nanopore ，
是利用電訊號的超酷創新定序方式，
也附上兩家的比較圖 :

(Logsdon, G. A., Vollger, M. R., & Eichler, E. E., 2020)

下回，三代定序生資分析

畢竟三代定序是近幾年來的新技術，
目前 TGS 平均定序價格仍較次世代高些，
對應的分析軟體也正在快速發展尚未完善，
更別說繁中的技術文章了，這也凸顯本系列文章的價值ヽ(✿ﾟ▽ﾟ)ノ，
之後會採用 PacBio SMRT Sequel II HiFi 16S rRNA Full Length (V1-V9) 做為範例。